作者: 和信治癌中心醫院臨床藥師 方麗華

很多人都以為基因編輯是21世紀的新鮮名詞，其實不然。在人類社會發展的歷史上，我們一直在嘗試做基因編輯的事情。比如，把吳郭魚培育成用仿鰻魚的台灣鯛魚，培育雜交水稻，優化農作物品種等等。這些例子，都可以看作是粗獷的“基因編輯”，也就是通過育種的方式，篩選人們想要的特徵。從基因層面上來說，控制特定的表現型正是“基因編輯”的終極目標。古時候沒有分子生物學，也不知道什麼是基因，所以只能通過雜交和選育來獲得目標的表現型。

進入分子生物學時代的今天，已經可以通過科學手段瞭解基因的 DNA 序列以及它在生物體中所起到的作用。那麼下一步，就是精準地對某一個或者某幾個基因進行編輯，從而控制特定的表現型了。

一、基因編輯的技術手段

科學家們為了解決編輯基因的問題，在技術手段上進行許多剪輯工具的創新。人類基因組序列中基因的數量有3萬多組，精準定位和編輯某個基因的問題一直到2006年第一個基因編輯酶 ZNF(zinc-finger nucleases) 的出現，人們才看到了一絲希望的曙光。隨後 TALEN(transcription activator-like effector nucleases) 和 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 的發現終於讓基因編輯在技術上變得相對容易，而 CRISPR-Cas9 技術更是把基因編輯技術推向新高潮。

不管是 ZNF，還是 TALEN 和 CRISPR，它們的基本原理都是一樣的。這三種編輯技術要完成一次編輯，都需要“定位器”“剪刀”和“修補匠”三個功能模組的合作。作為“定位器”的 DNA 序列是屬特異識別部分，是負責識別 DNA 序列的位置，目地是給“剪刀”帶路；作為“剪刀”的核酸酶負責把特定的 DNA 雙鏈結構一刀兩斷；作為“修補匠”的 DNA 修復系統負責在發現 DNA 結構斷裂後啟動修復功能。這其中，“修補匠”是生物體自帶的，而“定位器”加“剪刀”的系統，就是科學家們苦苦尋找和嘗試改良的部分。要想高效地編輯基因，“定位器”必須足夠精准，而“剪刀”必須足夠鋒利。那麼，在這三種基因編輯工具中，如果說 ZFN 和 TALEN 像是李逵拿著斧頭，有時候會傷及無辜，那麼 CRISPR-Cas9 技術就像是小李飛刀，更是刀無虛發。這是基因編輯技術的一大創新。

二、尋找該改寫的基因

基因編輯技術解決了編輯基因的問題，那麼，要怎樣才能從茫茫 DNA 序列中找到影響疾病發展或者影響動植物成長的關鍵基因呢？這個問題直到現在也沒有系統性的解決方法，我們只能根據以往文獻、臨床病人資料，再加上分子生物學實驗來確定某個基因主控了疾病的發展。雖然 CRISPR 技術的出現讓大家站在了同一起跑線上，但是懂得該編輯哪個或哪些基因的人才更有可能在自己的領域異軍突起。由於不同物種的基因組不同，即使相同的基因編輯手段也需要優化各種條件，而這是一個需要經驗積累的過程。舉個例子，美國明尼蘇達州的 Calyxt 公司是農作物育種領域的優秀範例。Calyxt 起初將 TALEN 基因編輯技術用於農作物，開發出一系列高含油量大豆、高纖維小麥、高抗旱大豆產品，而且很快這些產品將成為商業化品種上市。從2016年開始，Calyxt 申請了利用 CRISPR 實現基因編輯農作物的12項專利。

另一家公司 Recombinetics 則將基因編輯技術應用在畜牧業、家禽和水產上。比如現在農場飼養的奶牛品種頭上有牛角，這些牛角給它們相互打鬧以及農場工人帶來了威脅。而阿根廷的安格斯肉牛品種天然沒有牛角，Recombinetics 公司就通過基因編輯成功地培育出不長牛角的奶牛。

另外，還有一家基因工程企業 eGenesis，它致力於利用 CRISPR 技術去除豬基因組中潛在的病毒基因，培育能夠為人類提供器官移植供體的豬種。這幾家企業都出自對植物或動物基因編輯歷史悠久、學術成果等身的實驗室；它們早在 TALEN 時代，甚至更早時就開始了基因編輯產品轉化方向的研發，然後在 CRISPR 出現之後跟上時代潮流，它們利用本身積累的經驗，迅速搶佔了各自所在的細分領域的先機。


 

三、人體基因治療所面臨的挑戰

CRISPR 技術的誕生，讓基因編輯更廉價和易操作。那麼，掌握這項技術就能夠創業開發出新的基因治療產品了嗎？關於基因編輯的應用，在農牧業上的應用幾年之內就可能有產品上市，而最讓人期待的人體基因治療可能需要更長的時間。

人體上運用基因編輯技術，最大的挑戰在於載體技術。在農作物上進行基因編輯，我們可以保留編輯成功的細胞，扔掉編輯失敗的或者編輯錯的細胞。但是在人體內，基因編輯工具必須確保有效輸送到需要編輯的細胞上，而這正是體內基因編輯最難的地方。

目前，人體基因編輯輸送方式有體內輸送和體外輸送兩種。其中體內輸送的安全性隱憂更大，所以控制更嚴格。體外輸送是將血液抽出，在體外提取血液細胞，經編輯之後再輸回人體，雖然容易控制和操作，但是也只能應用於血液細胞。所以體外操作基因編輯的細胞成為了基因治療的先鋒。治療理論類似於CAR-T，在體外藉助攜帶病人所缺損的基因病毒，再利用病毒感染病人的幹細胞來進行改造，經改造後的幹細胞再回輸至病人體內。

迄今為止，只有歐洲藥品管理局批准上市的兩個基因治療藥物 Glybera 和 Strimvelis 都是經體外處理基因編輯後，再輸注入病人身體。前者用於治療脂蛋白酯酶缺乏症（Lipoprotein Lipase Deficiency ,LPLD），一次療法費用高達100萬美元，目的是減少胰臟發炎次數；後者治療的是另一種嚴重復合型免疫缺乏症或俗稱泡泡男孩(adenosine deaminase deficiency–severe combined immunodeficiency SCID)，用於找不到臍帶血相合時的幹細胞移植時，才考慮的基因移植治療，要價是60萬歐元。

因為基因治療面臨太多技術挑戰。在研發初期，醫藥公司都只敢從“非常嚴重的罕見遺傳病”入手，這樣產品才容易通過審批上市。嚴重復合型免疫缺乏症在新生兒發病率約在二十萬到百萬分之一。基因治療用於人類疾病的市場非常狹小，而且要價也非常昂貴。Glybera 也因為醫療支付能力，退出市場。

四、後CRISPR時代基因編輯走向？

CRISPR 技術引爆了基因編輯和基因治療的熱點，儘管這些基因編輯技術看上去幾乎無所不能，但事實上，它們仍然存在兩個明顯的缺陷：

一為潛在的脫靶效應，指的是基因編輯工具編輯了目標基因以外的基因。使得修復過程不可控制。二是基因編輯工具只負責“剪”，而修復過程在不同的細胞下，會有不同結果。有時會因為修復過於完全而導致編輯，看來根本不曾發生；有時也會因為修復而引入其他基因的突變。由於這些缺陷，所以不能直接運用編輯後的細胞，而是要反復確認細胞內是否發生了我們想要的編輯。照目前的技術看來，要應用在人體上，還有長路要走。

編譯作者: 資深臨床藥師方麗華

1.Porteus, M.H. Towards a new era in medicine: therapeutic genome editing. Genome Biol. 16, 286 (2015).

2. Cicalese MP, Ferrua F, Castagnaro L, et al  Update on the safety and efficacy of retroviral gene therapy for immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency. Blood. 2016 Jul 7;128(1):45-54

3. Gaudet D, Stroes ES, Méthot J, Brisson D, Tremblay K, Bernelot Moens SJ, et al. Long-Term Retrospective Analysis of Gene Therapy with Alipogene Tiparvovec and Its Effect on Lipoprotein Lipase Deficiency-Induced Pancreatitis. Hum Gene Ther. 2016;27: 916–925.